Making Blood Smear

Blood Smear - Blood Smear का प्रयोग CBC, PBS(Peripheral Blood Smear)/GBP(General Blood Picture) MP (Malaria Parasite) For Slide इत्यादि में किया जाता है।

Preparation of Blood Smear (ब्लड स्मीयर बनाने की तैयारी) –

Requirements (आवश्यक सामग्री) –

1)  Clean glass slide 

Glass Slide

2) Smooth edge spreader

3) Micro pipette with tips

Micro pipette

4) Cotton

5) Glass marking pencil

Procedure (Smear बनाने की विधि) –

• सबसे पहले एक ग्लास स्लाइड लेते है और उसे काटन से साफ करते है।
• अब माइक्रोपिपेट की सहायता से स्लाइड के एक सिरे के बीच के भाग पर ब्लड की एक बूँद रखते है।

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  Slide with Blood Drop

  अब एक साफ और बराबर किनारों वाले स्प्रीडर की सहायता से स्लाइड पर 35-40 डिग्री पर झुकाकर ब्लड से छुआते है जब ब्लड फैलने लगता है तब उसे स्लाइड पर आगे घसीटते है।
• इस प्रकार ब्लड स्मीयर बनकर तैयार हो जाता है अब स्मीर को सूखने के लिए छोड़ देते है।

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  Blood Smear

   स्मीर के सूखने के बाद स्लाइड स्टेनिंग के लिए तैयार हो जाता है।

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Total R.B.C. Count Test by Neubauer Chamber

Total R.B.C. Count test बहुत  महत्वपूर्ण  Blood test है जिसमें लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या को गिना जाता है।
लाल रक्त कोशिकाएँ हमारे शरीर के ऊतकों में आँक्सीजन का परिवहन करती है।

Requirement –

• Neubauer Chamber

• R.B.C. Pipette

• R.B.C. Diluting fluid

• Cover slip
• EDTA Blood Sample
• Microscope

Procedure –

• सबसे पहले Neubauer Chamber को Swab की सहायता से साफ करते हैं।
• अब R.B.C. Pipette जिसके बल्ब में लाल रंग का छोटा सा boll स्थित होता है में 0.5 mark तक ब्लड लेते हैं।

• अब उसी  R.B.C. Pipette  में 101 mark तक R.B.C. Diluting fluid लेते है और Pipette के बल्ब में ब्लड और R.B.C. Diluting fluid को 5 मिनट तक अच्छे से mix करते हैं।

• अब Neubauer Chamber पर साफ Cover slip रखते है।

• अब Pipette से शुरूआत के एक या दो बूँद Discard कर देते हैं और फिर Chamber और  Cover slip के बीच मिक्सचर की एक बूँद डालकर Chamber को Charge कर लेते है।

• अब Neubauer Chamber के बीचों बीच मौजूद स्क्वायर के किनारों के चार और बीच के एक खानों (कुल 5 स्क्वायर) को microscope की सहायता से Examine करते हैं और Red Blood Cells को count  करते है।

Calculation –

•  Total R.B.C. Count cell/cubic mm   = (4000/80×200)×Number of cells counted from 5 large square

     जहाँ – 4000/80 = Volume from which the cells have been counted

        200 = Dilution Factor

                                                                OR

•  Total R.B.C. Count    = 10,000× Number of cells counted from 5 large square

Normal values –

• In Male = 4.7 – 6.1 million cells/microliter
• In Female = 4.2 – 5.4 million cells/microliter

If Increased -

1. Fatigue (थकान होना)
2. Shortness of Breathing (श्वास फूलना)
3. Join Pain (जोड़ों में दर्द होना)
4. Tenderness  in Palm of Hands and sole of the Feet (हथेलियों एवं पंजों में पीड़ा होना)
5. Itching Skin (त्वचा में खुजलाहट होना)
6. Sleep Disturbance (अनिद्रा)

Increased RBC count को एरिथ्रोसाइटोसिस कहते है। कुछ कन्डीशन में या बीमारी की वजह से रक्त में इनकी संख्या अत्यधिक बढ़ जाती है जैसे –

1. Cigarette Smoking की वजह से RBC count बढ़ जाता है।
2. Congenital Heart Disease में RBC count बढ़ जाता है।
3. Dehydration में RBC count बढ़ जाता है।
4. Renal Cell Carcinoma (Kidney Cancer) में RBC count बढ़ जाता है।
5. Pulmonary Fibrosis में RBC count बढ़ जाता है।
6. Polycythemia Vera (A Bone Marrow Disease That Cause Over Production of RBC’s) में RBC count बढ़ जाता है।
7. कुछ दवाएं जैसे Gentamicin and Methyle Dopa  के कारण भी RBC count बढ़ जाता है।

If Dicreased-

1. Fatigue (थकान होना)
2. Shortness of Breath (श्वास फूलना)
3. Dizziness (चक्कर आना), Weakness (कमजोरी आना) 
4. Increased Heart rate
5. Headaches (सरदर्द होना) 
6. Pale Skin (त्वचा में पीलापन)

Decreased RBC Count को एनिमिया कहते है। कुछ बीमारियों की वजह से रक्त में इनकी संख्या घटकर अत्यधिक कम हो जाती है जैसे –

1. Anemia में RBC count कम हो जाती है।
2. Bone marrow failure होने में RBC count कम हो जाती है।
3. Erythropoietin Deficiency (Chronic Kidney Disease) में RBC count कम हो जाती है।
4. Transfusions and Blood Vessel Injury के कारण Hemolysis or RBC Destruction हो जाता है जिसके कारण RBC count कम हो जाती है।
5. Internal Bleeding or External Bleeding के कारण RBC count कम हो जाती है।
6. Malnutrition में RBC count कम हो जाती है।
7. Multiple Myeloma (Cancer of Plasma Cells in bone Marrow) में RBC count कम हो जाती है।
8. Nutritional Deficiency में जैसे Iron, Copper,Folate and Vitamin B6, B12 में RBC count कम हो जाती है। Pregnancy में RBC count कम हो जाती है।
9.  Thyroid Disease में RBC count कम हो जाती है।
10. कुछ दवाओं की वजह से भी RBC Count  कम हो जाती है जैसे Chemotherapy Drugs, Chloramphenicol (treat Bacterial Infection), Quinidine (treat Irregular Heart beat),Hydantoins (treat  Epilepsy)

!! Thank you !!

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Manually TLC/Total W.B.C.Count Test by Neubauer Chamber

Introduction -

TLC/Total WBC Count test एक  Blood test है जिसमें सफेद रक्त कोशिकाओं की संख्या को गिना जाता है।

 सफेद रक्त कोशिकाएँ हमारे शरीर को रोग-प्रतिरोधक क्षमता प्रदान करती है जो किसी बीमारी या इन्फेक्शन से हमारे शरीर की रक्षा करते हैं।

Requirement –

Neubauer Chamber

W.B.C. Pipette

W.B.C. Diluting fluid

TLC Test Kit

Cover slip

EDTA Blood Sample

Microscope

Microscope

Procedure –

1. सबसे पहले Neubauer Chamber को Swab की सहायता से साफ करते हैं।
   
   
2. अब W.B.C. Pipette जिसके बल्ब में सफेद रंग का छोटा सा boll स्थित होता है में 0.5 mark तक ब्लड लेते हैं।

   

   W.B.C. Pipette with White Boll

   

   Taking blood sample 

3. अब उसी  W.B.C. Pipette  में 11 mark तक W.B.C. Diluting fluid लेते है और Pipette के बल्ब में ब्लड और W.B.C. Diluting fluid को 5 मिनट तक अच्छे से mix करते हैं।
   
   

   

   Add W.B.C. Diluting Fluid

   Mixing Mixture in Pipette Bulb
4. अब Neubauer Chamber पर साफ Cover slip रखते है।

   

   Put cover slip 

5. अब Pipette से शुरूआत के एक या दो बूँद Discard कर देते हैं और फिर Chamber और  Cover slip के बीच एक Drop डालकर Chamber Charge कर लेते है।

   

   Charging Neubauer Chamber

6. अब Neubauer Chamber में मौजूद किनारों के चार खानों को microscope की सहायता से Examine करते हैं और W.B.C. count  करते है।

   

   Four large square of Neubauer chamber

   

   W.B.C. in a square

Calculation –

 T.L.C. or Total W.B.C. Count    = 10/4×20×Number of cells counted from 4 large square

Where - 

• 10/4 = Volume from which cells have been counted
• 20 = Dilution Factor 

                                                                OR
T.L.C. or Total W.B.C. Count    = 50× Number of cells counted from 4 large square

Normal values –

• Adult and Child = 4000 – 11000 cells/cubic mm
• Child under 2 years = 6200 – 17000 cells/cubic mm
• Newborn = 9000 – 30000 cells/cubic mm

 If Increased W.B.C. Count-

          

Increased WBC count को ल्यूकोसाइटोसिस कहते है। कुछ कन्डीशन में या बीमारी की वजह से रक्त में इनकी संख्या अत्यधिक बढ़ जाती है Up to 11000cell/cubic mm जैसे –

1. Bacterial Infection में WBC count बढ़ जाता है।
2. Trauma and Stress के कारण WBC count बढ़ जाता है।
3. Hemorrhage में WBC count बढ़ जाता है।
4. Dehydration में WBC count बढ़ जाता है।
5. Steroid Therapy में WBC count बढ़ जाता है।
6. Inflammations में WBC count बढ़ जाता है।
7. Thyroid hormone के बढ़ जाने के कारण भी WBC count बढ़ जाता है।
8. Leukaemias में W.B.C. count बढ़ जाता है।

If Decreased W.B.C. Count-

Decreased W.B.C. Count को ल्यूकोपीनिया कहते है। कुछ कन्डीशन में या बीमारी की वजह से रक्त में इनकी संख्या घटकर अत्यधिक कम हो जाती है Less then 4000cell/cubic mm जैसे –

1. Cytotoxic drugs के कारण W.B.C. count कम हो जाती है।
2. Bone marrow failure होने में W.B.C. count कम हो जाती है।
3. Sever Infection में W.B.C. count कम हो जाती है।
4. Iron deficiency and Vit. B12 deficiency में W.B.C. count कम हो जाती है।
5. Hypersplenism में W.B.C. count कम हो जाती है।
6. Autoimmune diseases में W.B.C. count कम हो जाती है।
7. Some Diseases like Typhoid fever, Malaria, Dengue,Influenza में W.B.C. count कम हो जाती है।
8. Tuberculosis में W.B.C. count कम हो जाती है।

 ! Thank you !

Estimation of Hemoglobin by Sahali's Method

हीमोग्लोबिन एक Protein Molecule है जो कि लाल रक्त कोशिकाओं में  उपस्थित रहता है। यह आँक्सीजन को फेफड़ों से शरीर के ऊतकों तक पहुँचाती है और बदले में कार्बन डाई आँक्साइड को ऊतकों से फेफड़ों तक पहुँचाती है।

हीमोग्लोबिन चार Protein Molecules (Globulin Chains) से मिलकर बना होता है जो आपस में परस्पर जुड़े होते है। Normal Adults के हीमोग्लोबिन Molecules में 2-Alpha – Globulin Chains and 2-Beta – Globulin Chains  मौजूद होते है। जबकि Fetuses and Infants  में 2-Alpha – Globulin Chains and 2-Gamma– Globulin Chains मौजूद होते है।

Principle – 

 Blood Sample  और N/10  HCl को Graduated Hemoglobin Tube में Add करते है और 8-10 minute के लिए Room Temperature पर Incubate करते है जिससे Blood और N/10  HCl , Reaction करके Acid-Hematin  में बदल जाती है। अब इस Acid-Hematin के Color  को Hemoglobinometer  के किनारों पर मौजूद comparator  (Browne colored Glass)  के Color से match कराते है और जब तक Color match नहीं हो जाता तब तक Acid Hematin  में Distilled Water Add  करते रहते है और जब Color match हो जाता है तब Graduated Hemoglobin Tube  को Measure  करके Reading  ले ली जाती है।

Requirement –

• Sahali’s Hemoglobinometer
• Graduated Hemoglobin Tube
• Haemoglobin Pipette
• Stirrer (Thin Glass Rod)
• N/10 HCL
• Distilled Water
• EDTA Blood or Capillary Blood 

 

Procedure –

• सबसे पहले Graduated Hemoglobin Tube में N/10 HCl को Tube में 2% Mark तक भरते है।
• अब इसमें Haemoglobin Pipette की सहायता 20µl  Mark तक EDTA Blood or Capillary Blood लेकर Graduated Hemoglobin Tube में उपस्थित N/10 HCl में मिलाकर Stirrer से अच्छे से Mix कर देते हैं।

  

  Blood Mixing in N/10 HCl
• अब इसे 8-10 मिनट तक Room Temperature पर रखते है जिससे Blood और HCl में Reaction होता है और अब यह Reaction Mixture Acid Hematin कहलाता है।

 

Wait 8-10 Minute

• अब इसमें Dropper की सहायता से Drop by Drop Distilled Water Add करते जाते हैं और Hemoglobinometer  के किनारों में मौजूद Standard Comparator (Brown Colored Glass) से Color को Match कराते है।
• Color Match हो जाने के बाद Graduated Hemoglobin Tube पर मौजूद Reading को देखकर Reading / Result दे देते हैं।

Measured Directly by Tube

Normal Value of Hemoglobin –

• In Men          =   13-17 g/dl

• In Women    =   12-15 g/dl

!! Thank you !!

H and E Staining Procedure (Hematoxylin and Eosin staining)

           

Histopathology में H and E  Staining  बहुत ही Basic Staining Technique है। इसमें दो Dye Hematoxylin and Eosin के Mixture का प्रयोग किया जाता है जिससे Cytoplasmic inclusions और Nucleus को Demonstrate करना अासान  हो जाता है।

Preparation of Slide –

Histopathology लैब में Slide तैयार करने के लिए Tissue Processing की जाती है जिसमें Tissue के Infected भाग को काटकर अलग कर लेते है अब उस Tissue का Dehydration, Clearing, Impregnation, Embedding और Microtome की सहायता से Cutting किया जाता है और तैयार Smear को Slide के बीचों-बीच में ले लिया जाता है इस प्रकार स्लाईड तैयार कर ली जाती है।

Tissue Smear

Requirement of H and E Staining –

1. Harri’s Hematoxylin
2. Eosin
3. 1%  HCl
4. Distilled Ammonia Water
5. Alcohol (100%, 90%, 80%, 70%)
6. Xylene
7. DPX (for mounting)
8. Cover Slip
9. Slide Stain tub

Preparation of Reagents –

1. Harri’s Hematoxylin Stain –

• A = 1 gm Hematoxyline  in 10 ml Ethenol
• B = 20 gm Ammonium Alum in Hot Distilled Water
• Mix A and B, Boil and add 0.5 gm of Mercuric Oxide and Filter.

 2. Eosin Solution –

• Yelow Eosin = 1 gm
• Distilled Water = 80 ml
• Ethenol = 320 ml
• Glacial acetic Acid = 2 drops

Procedure of H and E Staining –

1. For Deparaffinize The Section - सबसे पहले स्लाईड को 10 मिनट के लिए 50-60 डिग्री सेल्सियस पर Hot Plate  पर रखते है और फिर उसे Xylene  में कुछ Seconds  के लिए Dip  करते है जिससे Tissue Smear  में मौजूद wax remove हो जाता है ।

   

   Hot Plate or Slide Warmer

2. For Hydration – अब स्लाईड को Alcohol  के घटते हुए Concentration  में 100%, 90%, 80%, 70% में  और  Last  में Distilled Water / Tap water  में  Dip  कर लेते है।
3. अब स्लाईड को  Hematoxylin  में 5-10 मिनट के लिए Dip करते है।
   
4. अब स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में  Dip करके Hematoxylin को  Wash   कर लेते है।
5. अब स्लाईड को 5-10 second   के लिए 1% Acid Alcohol (1% HCL in 70% Alcohol)  में  Dip  करते है और दोबारा स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में Dip  कर लेते है।
6. अब स्लाईड को 5 मिनट के लिए  Ammonia Water में Dip करते है और इसे दोबारा  Water से Wash  कर लेते है।
7. अब स्लाईड को 10 मिनट के लिए 1% Eosin Yellow  में  Dip करते है और स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में Dip  कर लेते है।

   

   Eosin

    

8. For Dehydration - स्लाईड को Alcohol  के बढ़ते हुए Concentration  में 70%, 80%, 90%, 100% Alcohol में Dip करते है।
9. For Clearing -  स्लाईड को Xylene  में Dip  करते है।
10. अब  Tissue  को Mounting Media (DPX ) और Cover Slip  की सहायता से  Mount  कर लेते है।
11.  इस प्रकार  Tissue Microscopic Observation  के लिए तैयार कर लिया जाता है।

Result’s Interpretation – 

 

H and E Stained Tissue Smear

• Nuclei = Blue / Black
• Cytoplasm = Pink
• Muscle Fibers = Deep Red
• RBCs = Orange Red
• Fibrin = Deep Pink

 

!!Thank you !!

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