Widal Test

Widal Test एक Agglutination Test है। इसकी खोज सन् 1896 ई0 में Sir, Georges Ferdinand Widal ने की। इस टेस्ट में Salmonella Species (ग्राम निगेटिव बेसिलाई) को Detect करते है। जिसके कारण Enteric Fever हो जाता है और इस Enteric Fever के अंतर्गत Typhoid and Para Typhoid Fever आता है। 

Salmonella 

Acute Typhoid Fever में “O” Agglutinins 6-8 दिनों के बाद detect होते है तथा “H” Agglutinins 10-12 दिनों के बाद detect होते है ।

Endemic Typhoid Fever में Salmonella Antibody 1^st week के end में Human Serum में थोड़े थोड़े उपस्थित होने लगते है और  3^rd Week तक ये आसानी से Human Serum में detect होते है ।

Methods –

Slide Qualitative Test

Slide Quantitative Test

Test Tube Quantitative Test

Requirement –

1. Widal Test Kit

Widal Test Kit

• S.Enterica serotype Typhi O
• S.Enterica serotype Typhi H
• S.Enterica serotype Para Typhi AH
• S.Enterica serotype Para Typhi BH
• Positive Control
• Negative Control

  2. Slide for slide method
 3. Test Tube for test tube method
 4. Test Tube Stand
 5. Incubator
 6. Normal Saline
 7. Graduated Pipette
 8. Applicator Sticks
 

Slide Qualitative Test –

1. सबसे पहले widal test kit के reagents को कुछ समय के लिए refrigerator से बाहर निकाल कर रखते है ताकि reagents room temperature पर आ जाए।
2. अब एक सफेद colour की multicircle वाली slide लेते है और उसे cotton से साफ करते है।
3. अब स्लाइड के पहले circle में S. Typhi O और दूसरे circle में S. Typhi H antigen की एक एक बूँद डालते है। 
4. अब स्लाइड के तीसरे circle में S.Para Typhi AH और चौथे circle में S. Para Typhi BH antigen की एक एक बूँद डालते है।
5. अब स्लाइड के पाँचवे circle में Negative Control और छठे circle में Positive Control की एक एक बूँद डालते है।
6. अब स्लाइड के पहले circle से लेकर चौथे circle में Human Serum की एक एक बूँद डालते है।
7. अब स्लाइड के पाँचवे circle में और छठे circle में H Antigen की एक एक बूँद डालते है।
8. अब स्लाइड के सभी circle को अलग अलग Applicator Sticks की सहायता से mix करते है और कुछ समय के बाद Agglutination Reaction check करते हैं।

Result –

Positive Agglutination Result

• यदि Agglutination Reaction दिखलाई पड़ता तो Test Positive है जिसका मतलब है कि व्यक्ति को Typhoid fever है।

• यदि Agglutination Reaction दिखलाई नहीं पड़ता है तो Test Negative है जिसका मतलब है कि व्यक्ति को Typhoid fever नहीं है।

Slide Quantitative Test –

1. सबसे पहले widal test kit के reagents को कुछ समय के लिए refrigerator से बाहर निकाल कर रखते है ताकि reagents room temperature पर आ जाए।
2. अब दो सफेद colour की multicircle वाली slide लेते है और उसे cotton से साफ करते है।
3. अब Micropipette की सहायता से 80µL, 40µL, 20µL, 10µL, 5µL Human serum स्लाईड के चार लाइनों में क्रमवत पहले circle से लेकर पाँचवें circle तक में लेते हैं।
4. अब slide के पहले लाईन में S. Typhi O Antigen की एक एक बूँद क्रमवत 80µL, 40µL, 20µL, 10µL, 5µL में डालते है।
5. अब slide के दूसरे लाईन में S. Typhi H Antigen की एक एक बूँद क्रमवत 80µL, 40µL, 20µL, 10µL, 5µL में डालते है।
6. अब slide के तीसरे लाईन में S. Para Typhi AH Antigen की एक एक बूँद क्रमवत 80µL, 40µL, 20µL, 10µL, 5µL में डालते है।
7. अब slide के चौथे लाईन में S. Para Typhi BH Antigen की एक एक बूँद क्रमवत 80µL, 40µL, 20µL, 10µL, 5µL में डालते है।
8. अब स्लाइड के सभी circle को अलग अलग Applicator Sticks की सहायता से mix करते है और कुछ समय के बाद Agglutination Reaction check करते हैं।

Result –

Circle no.              1                              2                              3                              4                    5

Serum Vol.           80 µL                      40 µL                  20 µL                  10 µL                  5µL

Amount of Ag.     1drop                    1drop                    1drop                    1drop               1drop

Eq.Tube Titer       1:20                     1:40                        1:80                        1:160             1:320        

Test Tube Quantitative Test –

1. सबसे पहले Master Solution तैयार करते है जिसके लिए 4 sets में 8 Kahn Tube (3×0.5ml) लेते हैं  जिसका मतलब है कि कुल 32 Test Tube लेते हैं और इन्हें 4 भागों में बाँट देते हैं और इन्हे मार्कर की सहायता से O,H,AH,BH के नाम से Label कर देते हैं।
2. अब Micropipette की सहायता से पहले Test Tube मॆ 1.9ml और अन्य सभी Test Tube में 1ml Isotonic Saline या Normal Saline लेते हैं।
3. अब पहले Test Tube मॆ 0.1ml Human Serum लेते हैं  और Micropipette की सहायता से अच्छे से Mix करते हैं और इसी पहले Test Tube मॆ से 1ml Solution निकाल कर दूसरे Test Tube मॆ डाल देते है और फिर उसे अच्छे से Mix करते हैं।
4. अब दूसरे Test Tube मॆ से 1ml Solution निकाल कर तीसरे Test Tube मॆ डाल देते है और फिर उसे अच्छे से Mix करते हैं यह क्रम सातवें Test Tube तक चलता है और आखिरी में बचे Solution को फेंक दिया जाता हैं, इस प्रकार हमारा Master Solution तैयार हो जाता हैं।
5. आखिरी के सभी आठवें नम्बर के Test Tube का प्रयोग Saline Control के रुप में करते है जिसमें 1ml Normal Saline डालते हैं।
6. अब पहले sets के 1 से लेकर 8 तक के Test Tubes मॆ S. Typhi O Antigen की एक एक बूँद क्रमवत डालते है।
7. अब दूसरे sets के 1 से लेकर 8 तक के Test Tubes मॆ S. Typhi H Antigen की एक एक बूँद क्रमवत डालते है।
8. अब तीसरे sets के 1 से लेकर 8 तक के Test Tubes मॆ S. Para Typhi AH Antigen की एक एक बूँद क्रमवत डालते है।
9. अब चौथे sets के 1 से लेकर 8 तक के Test Tubes मॆ S. Para Typhi BH Antigen की एक एक बूँद क्रमवत डालते है।
10. अब सभी Test Tube को अच्छे से Mix करते हैं और कवर से ढककर लगभग 18 घंटों के लिये Room Temperature (37*C) रख देते है।
11. अब सभी Test Tubes में हुए Agglutination Reaction को Observe करते है।

Result –

     Test Tube -        1       2       3        4           5          6            7

  Eq.Tube Titer - 1:20  1:40   1:80   1:160   1:320    1:640     1:1280

1. यदि Test Tubes 1 में Agglutination Reaction है तो reading 1:20 होगी।
2. यदि Test Tubes 2 में Agglutination Reaction है तो reading 1:40 होगी।
3. यदि Test Tubes 3 में Agglutination Reaction है तो reading 1:80 होगी।
4. यदि Test Tubes 4 में Agglutination Reaction है तो reading 1:160 होगी।
5. यदि Test Tubes 5 में Agglutination Reaction है तो reading 1:320 होगी।
6. यदि Test Tubes 6 में Agglutination Reaction है तो reading 1:640 होगी।
7. यदि Test Tubes 7 में Agglutination Reaction है तो reading 1:1280 होगी।

Note:- (यदि 1 से लेकर 3 Test Tubes तक में ही Agglutination Reaction है यानि 1:80 Reading है या इससे भी कम है तो Test Negative है और यदि 4,5,6,7 Test Tubes में Agglutination Reaction है यानि 1:80 से अधिक Reading है तो Test Positive है।)

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