H and E Staining Procedure (Hematoxylin and Eosin staining)

           

Histopathology में H and E  Staining  बहुत ही Basic Staining Technique है। इसमें दो Dye Hematoxylin and Eosin के Mixture का प्रयोग किया जाता है जिससे Cytoplasmic inclusions और Nucleus को Demonstrate करना अासान  हो जाता है।

Preparation of Slide –

Histopathology लैब में Slide तैयार करने के लिए Tissue Processing की जाती है जिसमें Tissue के Infected भाग को काटकर अलग कर लेते है अब उस Tissue का Dehydration, Clearing, Impregnation, Embedding और Microtome की सहायता से Cutting किया जाता है और तैयार Smear को Slide के बीचों-बीच में ले लिया जाता है इस प्रकार स्लाईड तैयार कर ली जाती है।

Tissue Smear

Requirement of H and E Staining –

1. Harri’s Hematoxylin
2. Eosin
3. 1%  HCl
4. Distilled Ammonia Water
5. Alcohol (100%, 90%, 80%, 70%)
6. Xylene
7. DPX (for mounting)
8. Cover Slip
9. Slide Stain tub

Preparation of Reagents –

1. Harri’s Hematoxylin Stain –

• A = 1 gm Hematoxyline  in 10 ml Ethenol
• B = 20 gm Ammonium Alum in Hot Distilled Water
• Mix A and B, Boil and add 0.5 gm of Mercuric Oxide and Filter.

 2. Eosin Solution –

• Yelow Eosin = 1 gm
• Distilled Water = 80 ml
• Ethenol = 320 ml
• Glacial acetic Acid = 2 drops

Procedure of H and E Staining –

1. For Deparaffinize The Section - सबसे पहले स्लाईड को 10 मिनट के लिए 50-60 डिग्री सेल्सियस पर Hot Plate  पर रखते है और फिर उसे Xylene  में कुछ Seconds  के लिए Dip  करते है जिससे Tissue Smear  में मौजूद wax remove हो जाता है ।

   

   Hot Plate or Slide Warmer

2. For Hydration – अब स्लाईड को Alcohol  के घटते हुए Concentration  में 100%, 90%, 80%, 70% में  और  Last  में Distilled Water / Tap water  में  Dip  कर लेते है।
3. अब स्लाईड को  Hematoxylin  में 5-10 मिनट के लिए Dip करते है।
   
4. अब स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में  Dip करके Hematoxylin को  Wash   कर लेते है।
5. अब स्लाईड को 5-10 second   के लिए 1% Acid Alcohol (1% HCL in 70% Alcohol)  में  Dip  करते है और दोबारा स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में Dip  कर लेते है।
6. अब स्लाईड को 5 मिनट के लिए  Ammonia Water में Dip करते है और इसे दोबारा  Water से Wash  कर लेते है।
7. अब स्लाईड को 10 मिनट के लिए 1% Eosin Yellow  में  Dip करते है और स्लाईड को 5 मिनट के लिए Water  में Dip  कर लेते है।

   

   Eosin

    

8. For Dehydration - स्लाईड को Alcohol  के बढ़ते हुए Concentration  में 70%, 80%, 90%, 100% Alcohol में Dip करते है।
9. For Clearing -  स्लाईड को Xylene  में Dip  करते है।
10. अब  Tissue  को Mounting Media (DPX ) और Cover Slip  की सहायता से  Mount  कर लेते है।
11.  इस प्रकार  Tissue Microscopic Observation  के लिए तैयार कर लिया जाता है।

Result’s Interpretation – 

 

H and E Stained Tissue Smear

• Nuclei = Blue / Black
• Cytoplasm = Pink
• Muscle Fibers = Deep Red
• RBCs = Orange Red
• Fibrin = Deep Pink

 

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